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ELISA試劑盒顯色和比色分析
發(fā)布時間： 2017-10-23 點擊次數： 1688次在ELISA試劑盒試驗中各種酶標儀功能都會有所不同，所以在運用中應具體閱讀說明書，再進行下一步操作。
自從20世紀60-70年代面世以來，Elisa法得到*科研工作者的認可及推重，在歐美及我國取得很大的推行，尤其是國內生化范疇的長足發(fā)展。ELISA試劑盒有著準確性高、靈敏度高、特異性強等許多的長處，它在檢測抗體、抗原等方面有很好的運用，深受廣闊用戶朋友的喜愛。但是，在試驗過程中，也需求留意許多問題，特別是顯色、比色問題。
顯色
ELISA試劑盒顯色是ELISA中的終究一步溫育反響，此刻酶催化無色的底物生成有色的產品。反響的溫度和時刻仍是影響顯色的要素。在一定時刻內，陰性孔可堅持無色，而陽性孔則隨時刻的延伸而呈色加強。恰當提高溫度有助于加快顯色進行。在定量測定中，參加底物后的反響溫度和時刻應按規(guī)則力求準確。定性測定的顯色可在室溫進行，時刻一般不需求嚴格控制，有時可根據陽性對照孔和陰性對照孔的顯色恰當縮短或延伸反響時刻，及時判別。
OPD（鄰苯二胺）底物顯色一般在室外溫或37℃反響20-30分鐘后即不再加深，再延伸反響時刻，可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色，顯色反響應避光進行，顯色反響結束時參加停止液停止反響。OPD產品用硫酸停止后，顯色由橙轉向棕。
TMB（四甲基聯苯胺）受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反響觀察成果。但為確保試驗成果的安穩(wěn)性，宜在規(guī)則的恰當時刻閱讀成果。TMB經HRP作用后，約40分鐘顯色達高峰，隨即逐漸削弱，至2小時后即可*消退至無色。TMB的停止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反響停止。這類停止劑尚能使藍色維持較長時刻（12-24小時）不褪，是目視判別的杰出停止劑。此外，進口elisa試劑盒各類酸性停止液則會使藍色轉變成，此刻可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。
比色
比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗，需先將板置于規(guī)范96孔的座架中，才可進行比色。在加底物液顯色前，先將軟板邊際剪凈，這樣，此板就可*平妥坐入座架中。
比色時應先以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經任何反響僅加底物液的孔）和空白孔，以記載本次試驗的試劑情況。這以后可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行核算。
比色成果的表達以往通用光密度（oplical density，OD），現按規(guī)則用吸光度（absorbence，A），兩者意義相同。一般的表明辦法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表明辦法為“A492nm”或“OD492nm”。
酶標比色儀
酶標比色儀簡稱酶標儀，一般指于測讀ELISA成果吸光度的光度計。針對固相載體方式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設計。許多試劑公司配套供應酶標儀。酶標儀的主要功能指標有：測讀速度、讀數的準確性、重復性、準確度和可測規(guī)模、線性等等。的酶標儀的讀數一般可準確到0.001，準確性為±1%，重復性達0.5%。舉例說，若某孔測得的A值為1.083，則該孔相對于空氣的實在A值應為1.083± 0.01(1.073～1.093)，重復測定數次，其A值均應1.083±0.05（1.078～1.088）在之間。酶標儀的可測規(guī)模視各酶標儀的功能而不同。一般的酶標儀在0.000～2.000，新型號的酶標儀上限拓展達2.900，乃至更高。超出可測上限的A值常以“*”或“over”或其它符號表明。應留意可測規(guī)模與線性規(guī)模的不同，線性規(guī)模常小于可測規(guī)模，比方某一酶標儀的可測規(guī)模為0.000～2.900，而其線性規(guī)模僅0.000～2.000，這在定量ELISA中制造規(guī)范曲線時應予留意。
酶標儀不該安頓在陽光或強光照射下，操作時室溫宜在15-30℃，運用前先預熱儀器15-30分鐘，測讀成果更安穩(wěn)。
ELISA試劑盒測讀A值時，要選用產品的靈敏吸收峰，如OPD用492nm波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀，即每孔先后測讀兩次，*次在zui適波長（W1），第2次在不靈敏波長（W2），兩次測定間不移動ELISA板的方位。例如OPD用492nm為W1，630nm為W2，終究測得的A值為兩者之差（W1-W2）。雙波長式測讀可削減由容器上的劃痕或指印等造成的光攪擾。
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