真菌毒素檢測技術與產品服務（3）

發布時間： 2009/3/27　　點擊次數： 2923次

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液相色譜法測定谷物中黃曲霉毒素B1、G1、B2、G2含量

     摘要用一種快速方便的真菌毒素多功能凈化柱處理樣品,然后用液相色譜對谷物中黃曲霉毒素B1、G1、B2、G2進行測定。樣品經乙腈-水（體積比84：16）提取，提取液通過真菌毒素多功能凈化柱凈化、濃縮，三氟乙酸（TFA）柱前衍生，C18色譜柱分離，熒光檢測器檢測，外標法定量。對添加兩個濃度黃曲霉毒素的玉米樣品進行加標回收實驗，4種毒素的回收率均在90.44%～101.23%之間，B1、G1、B2、G2的zui低檢測限分別為2.0、1.0、0.5、0.5ng/kg。實驗結果表明，此法不僅定量準確，精密度高而且操作極為方便。

真菌毒素對糧食飼料的污染是一個性的問題，我國因是農業大國和人民以谷物為主食的飲食習慣，使真菌毒素的污染問題顯得更為突出。黃曲霉毒素是真菌毒素的重要代表之一，對世界上30多個國家和地區進行的調查表明，危害程度排在*位的是黃曲霉毒素。它是由黃曲霉、寄生曲霉和集峰曲霉產生的一組結構類似的化合物[1]，均為二呋喃香豆素（difuranocoumarin）的衍生物。雖然黃典霉毒素（AF）的衍生物有20多種，目前已分離鑒定出的AF包括：AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2、AFP1、AFQ、AFH1、AFGM、AFB2a和毒醇等12種，但天然污染糧油食品的AF是B組和G組兩大類，即AFB1、AFB2、AFG1和AFG2。黃曲霉毒素的毒性，致突變及致癌作用已得到明確證實。它由強到弱的順序依次為AFB1> AFG1>AFM1>AFB2>AFG2[2]。歐盟的黃曲霉毒素的*AFB1是4μg/kg。
    霉菌毒素的檢測定量一直是個難點，目前黃曲霉毒素檢測的國標方法有薄層色譜法、酶聯免疫法、免疫親和柱凈化液相色譜法。薄層色譜法操作繁瑣、污染大、定量差、耗時長；而酶聯免疫法雖操作簡單、靈敏度高，但特異性差；免疫親和柱液相色譜法是柱后衍生法，它對于高黃曲霉毒素含量的樣品偏差較大。且柱后衍生不普及,給使用帶來不便。本文所述方法用真菌毒素多功能凈化柱快速凈化，液相柱前衍生法簡單方便，靈敏度和特異性高，又能避免氯仿等有毒試劑的使用,是一種值得推廣的好方法。這種方法，在上不少試驗室已得到確認，還被作為AOAC的*方法。
1 材料與方法
1.1 試劑和儀器
    乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、*（分析純）、去離子水、PuriTox^SR160真菌毒素多功能凈化柱、液相色譜儀、2475熒光檢測器。
1.2 標準品的準備
    標準品包括了黃曲霉毒素B1、G1、B2、G2各單一標準液和混合標準液，溶劑為乙腈，黃曲霉素混合標準液的濃度為2μg/ml B1、G1以及0.5μg/ml B2、G2。單一標準液用來確定各自的保留時間，具體工作用混合標準液是將所提供標準液稀釋10倍，用微量注射器分別取5.0、10.0、20.0、25.0、40.0、50.0μl稀釋標準液（具體濃度為200ng/ml的B1、G1；50ng/ml的B2、G2），和樣品一樣蒸干，用三氟乙酸衍生，定容于0.2ml流動相，故所得進針的濃度分別是：B1、G1為5.0、10.0、20.0、25.0、40.0、50.0ng/ml；G2、B2為1.25、2.5、5.0、6.25、10.0、12.5ng/ml。
1.3 樣品
    實驗所用樣品包括玉米、小麥等，取代表樣品5kg，粉碎，充分混合均勻，四分法縮至500g。因霉菌毒素分布不均勻，充分混合非常重要，必要時取樣量加大（有地方建議取15kg）。
1.4 樣品的提取和凈化
    使用粉碎機將樣品研細，稱取25g研細樣品置于250ml的燒瓶或攪拌瓶中。加入100ml乙腈-水（體積比84：16）溶液。在旋轉震蕩器上震蕩1h。用漏斗、定性濾紙將其過濾到樣品瓶中。轉移8ml樣品提取液通過PuriTox^SR160真菌毒素多功能凈化柱，推出大約4ml的凈化液（具體過程見圖1），轉移2ml已凈化的提取液至潔凈的棕色瓶。在水浴60℃條件下用氮氣吹干。

1.5 柱前衍生及液相色譜條件
    向剩余物中加入200μl正己烷、100μl三氟乙酸，立即旋緊蓋子。渦旋30s，在40℃烘箱中衍生15min，室溫下氮氣吹干混合物，用200μl水-乙腈（體積比85：15）溶解殘余物并渦旋30s，將其轉移到1.5ml的離心試管中以10 000r/min的速度離心5min，把已經制備凈化好的150μl樣品液轉移到HPLC樣品瓶，進樣25μl。液相色譜條件見表1。
2 結果與討論
2.1 4種黃曲霉毒素的分離情況
    取50μl黃曲霉毒素混標工作溶液（濃度為B1、G1 200ng/ml；G2、B2 50ng/ml）于棕色瓶內，吹干，衍生，流動相定容，經液相色譜分離得出的標準色譜分離見圖2。黃曲霉毒素G1、B1的濃度為50ng/mlG2、B2的濃度為12.5ng/ml。
2.2 標準曲線及回歸方程
    按實驗方法進行測定，4種黃曲霉毒素的標準曲線、回歸方程及檢出限（按3倍信噪比計算）的測定結果見圖3和表2。
2.3 樣品的加標回收實驗
    取玉米樣品一份，分別做兩個濃度的加標回收實驗。具體做法是：取8ml黃曲霉素空白樣的提取液,分別加10μl和 25μl黃曲霉素混合標準液（1 000ng/ml黃曲霉素B1、G1以及250ng/ml黃曲霉素B2、G2）作為加標。經過和樣品一樣的處理,得出其zui后的理論濃度見下式。
    ①B1、G1濃度：（0.010ml×1 000ng/ml）/8ml×（2ml/0.2ml）=12.5ng/ml；
（0.025ml×1 000ng/ml）/8ml×（2ml/0.2ml）=31.25ng/ml。
    ②B2、G2濃渡：
（0.010ml×250ng/ml）/8ml×（2ml/0.2ml）=3.125ng/ml；
（0.025ml×250ng/ml）/8ml×（2ml/0.2ml）=7.812 5ng/ml。
2.4 精密度實驗
    按實驗方法進行樣品處理，對同一樣品連續測定5次。
2.5 樣品調查
    從市面上抽取10份玉米樣品,按此實驗方法進行處理，結果為未檢出黃曲霉毒素。此方法簡便易行、快速準確、靈敏度高、檢測限低，適合大批量檢測，值得推廣。

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