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真菌毒素檢測技術與產品服務（1）
發布時間： 2009/3/27 點擊次數： 3002次提 供 商： 研域（上海）化學試劑有限公司 資料大小： 圖片類型： 下載次數： 174 次 資料類型： 瀏覽次數： 3002 次 相關產品： 詳細介紹： 液相色譜法測定谷物中赭曲霉毒素含量
摘要：研究了液相色譜法測定谷物中赭曲霉毒素的方法。樣品經乙腈水（84：16）提取，提取液通過PuriToxSR 130赭曲霉毒素凈化柱凈化、濃縮，C18色譜柱分離，熒光檢測器檢測，外標法定量。對添加兩個濃度赭曲霉毒素的玉米樣品進行加標回收實驗，平均回收率為99.12%和103.09%，變異系數分別為0.281%、1.214%，zui低檢測限為0.20ng/kg，方法簡便易行，準確精密度高，值得推廣。Abstract: HPLC is applied to the determination of ochratoxin A in grains .The sample is extracted with 84/16 acetonitrile/water. Filtrace is cleaned up by ochratoxin purification column. Fluorescent ochratoxin A is separated on NovapakC18 column,and is detected by fluorescent detector and is quantified by external standard. Corn samples are fortified with ochratoxin A at the twe levels. Five replicate analysis are performed each level. The recoveries of ochratoxin A are 99.30%~103.09%.The variation coefficients are 0.281%~1.214%.The detection limit is 0.20ng/kg. The precision and accuracy of this method are satisfactory.霉菌遍布世界各地，種類繁多，依生活習性，分為倉儲霉菌和田間霉菌。赭曲霉毒素（簡稱OTA）是溫暖地區zui重要的倉儲毒素，廣泛存在于玉米、大麥、小麥和飼料中,麩皮的污染高于整粒谷物。在熱帶和亞熱帶地區主要由曲霉菌產生，而溫暖地區則由青霉屬產生。廣東地處亞熱帶，溫濕度十分適宜霉菌的生長，據有關調查該毒素污染在飼料原料和配合飼料中普遍存在，陽性率大于60%2。赭曲霉毒素危害很大，據報道，每千克飼料中含有0.2-0.3克，就可使雞中毒，zui常見的臨床表現有：鈣磷吸收障礙，骨骼脆弱，蛋殼鈣化不全，破蛋率高，皮下出血，容易挫傷。對家畜主要攻擊腎臟、免疫系統和造血系統，肝臟變得脆弱，劇渴，生長遲緩，多尿、下痢、糖尿癥。癌癥研究機構（IARC）已證明OTA對人可能是致癌的。有建議指出OTA引起地方腎病和膀胱腫瘤。但 FAO/WHO專家協會指出，以上這些結論證據不足，其他的腎毒性可能起著重要作用（WHO2002）。一些國家已經制定*，歐盟對麥片的*是5ug/ml3.根據中國國家有關規定，玉米中赭曲霉毒素的zui高*為：20ug/kg.現常用的檢測方法多為薄層色譜和酶聯免疫法，薄層色譜法操作繁瑣，污染大、定量差，耗時長，而酶聯免疫法雖操作簡單，但存在假陽性，準確性欠佳，此液相色譜法操作簡便，快速，準確靈敏度高，不失為一種好方法。1.實驗部分：1.1試劑和儀器乙 腈（色譜純） 冰醋酸（分析純） 去離子水赭曲霉標準液：10ug/ml 溶劑為乙腈PuriToxSR 130赭曲霉毒素凈化柱Waters2695液相色譜儀熒光檢測器1.2步驟1.2.1 取樣：取代表樣品5kg，粉碎，充分混合均勻，四分法縮至500g, 因霉菌毒素分布不均勻，充分混合非常重要，必要時取樣量加大，有地方建議取15kg。1.2.2 提取：取25g粉碎樣品于250ml三角燒瓶內，加100ml乙腈水（84：16），在振蕩器上振蕩1小時，用定量濾紙過濾。1.2.3 標準準備：將50ul 10ug/ml 的赭曲霉毒素在一個棕色瓶子里吹干，用10ml的流動相進行溶解，渦旋1分鐘，此為50ng/ml的赭曲霉毒素標準液；另將1 ml10ug/ml的赭曲霉毒素在一棕色瓶子內吹干，用10ml的流動相溶解，渦旋1分鐘，此為1ug/ml的赭曲霉加標標準溶液。1.2.4 凈化濃縮：取7ml的樣品提取液進一玻璃試管內（與前處理柱配套提供）（加標時取7ml的空白樣品分別加10ul和35ul的1ug/ml的赭曲霉標準溶液）,加70ul的冰已酸，混合，用PuriToxSR 130赭曲霉毒素凈化柱凈化萃取液,然后將凈化液，轉移4ml的凈化液到另一試管，60℃水浴中氮氣吹干，用400ul的流動相（60/40/1水/乙腈/乙酸）溶解，渦旋30min ，轉移到1.5ml的離心管內10000rpm離心5分鐘，轉移350ul 的清潔樣品進入液相。1. 3儀器條件Waters2695液相色譜儀，2475熒光檢測器色譜柱：NovapakC18（5um） 3.90*150mm Waters PAHC18（5um）4.6*150mm流動相：60/40 水/乙腈流速：0.5ml/min 運行時間：20min柱溫：40℃進樣體積：60ulEX:330nm EM:460nm2. 0測定結果2.1 標準曲線及回歸方程：取制定好的50ng/ml的標準溶液，用流動相分別稀釋成1、2、5、10、20、30、50ng/ml的濃度，制成標準曲線。表1. 標準曲線的基本參數：濃度范圍1.02.05.010.020.030.050.0峰面積103454.993210799.985515389.9641064099.9262285364.8403442139..7605463738.891相關系數0.9995回歸方程Y=1.11×105X-1.85×103檢測限0.20ng/kg（按3倍信噪比計算）2.2不同濃度添加回收實驗：取玉米樣品1份，分別做兩個濃度的加標回收實驗，結果見表2。表2.兩個濃度的樣品添加回收實驗結果表：組分本底值添加標準液的體積10ul35ul赭曲霉毒素0添加處理后理論濃度14.28ng/ml50.0ng/ml添加次數1234512345添加后測得濃度（ng/ml）14.1814.1614.1314.2014.1052.0652.1651.1351.6850.69回收率99.3099.1698.9599.4498.74104.12104.32102.26103.36101.38平均值99.12103.09RSD（%）0.2811.2142.3精密度實驗：選擇不同含量的玉米樣品兩份，分別平行測定8次，結果見表3表3.精密度實驗結果檢測次數12345678平均值RSD樣品1測定值11.2311.4611.4111.3611.8711.9711.6711.7511.592.27樣品2測定值（ng/ml）28.5728.6228.6828.9828.8728.1228.9228.5328.660.9633.0結論：此方法簡便易行，快速準確，靈敏度高，檢測限低，適合大批量檢測，值得推廣4.0參考文獻：王若軍,苗朝華,張振雄.中國飼料及飼料原料受霉菌毒素污染的調查報告.<<飼料工業>>2004.2（21）.:25（3）G.. Buttinger, E.Fuchs,H.Knapp,F.Berthiller,2004,Performance of new clean-up column for the determination of ochratoxin A in cereals and foodstuffs by HPLC-FLD.Food Additives and Contaminants,11,1107-1114.
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